1.人体中的自由基从何而来？

氧化作用，在自然界非常常见。比如一根火柴的燃烧是氧化作用，铁会生锈也是氧化作用，放了很久的食用油酸败也是氧化作用，细胞代谢将我们吸收的食物中的营养物质转化成我们细胞可以利用的能量分子也是氧化作用，自由基攻击细胞中的蛋白质、DNA也是氧化作用。氧化作用有好坏之分吗？自由基是十恶不做的吗？

人类，作为铁杆的需氧生物，我们需要不断的利用氧气，氧化营养物质制造生物能量。这个依靠氧气产生能量的过程就在细胞的“能量工厂”线粒体中进行。进入人体的98%以上的氧气都被细胞充分利用，产生能量分子ATP，氧气自身则被还原为水。而剩下不到2%的氧气形成活性氧形式的自由基。

“万病之源”自由基

线粒体的有氧呼吸产生的自由基为正常代谢的副产物。人体中自由基的来源还有很多，特别是在病理状态下。当发生炎症、缺血、心肌梗死、脑血栓发作、压力过大等情况时，身体就会产生内源性的自由基。医学上还有一种情况叫“血流再灌注损伤”，讲的是当体内部分组织因为缺血而血液停止流动到再开始流动的这一瞬间，都会爆发性地产生大量自由基。

正常情况下原子周围排布着成对的电子。自由基的形成是由于共价键发生均裂而形成的具有不成对电子的原子或基团。自由基作为一种强氧化性的极活跃物质，它可以从细胞中的脂质、蛋白质、核酸分子中夺取电子，使自己稳定，而被自由基攻击的分子就被氧化而丧失功能。然而，自由基最可怕的不在于它的氧化性，而在于它剥夺其他分子的电子，导致其他分子也变成不稳定的自由基，能在短时间内引发大量自由基的产生，如同推翻多米诺骨牌，一发不可收拾。

自由基抢夺正常分子的电子，使其丧失功能

自由基如此巧取豪夺，那是不是百害而无一利呢？其实细胞内低水平的自由基是提醒细胞开启自我修复的重要信号，还能开启免疫细胞活性。甚至人体免疫系统中的吞噬细胞在面对病毒或微生物入侵人体时，也会产生大量的氧自由基来杀死入侵者，这个过程称之为“氧爆发”。然而氧爆发产生的大量自由基却是不分敌友的，这些自由基会杀死病毒的同时也会杀死吞噬细胞，甚至殃及池鱼，引起器官或组织损伤。

既然低水平的自由基对细胞有用，而高水平的自由基则由于“人多势众”杀红了眼而无法收手，那么怎么保持细胞内的自由基水平不会超标呢？这这要依靠细胞的一套完整的抗氧化防御系统。

2. 细胞的抗氧化防御系统

抗氧化的关键两点在于：1.中断自由基引发的链式反应，2.抓住和消除罪魁祸首自由基。因此抗氧化剂也可以据此分为两类，第一类为非酶类，作用是中断自由基链反应。第二类为酶类，作用在于打破和清除自由基。

非酶类的抗氧化剂包括微量元素（硒、锌）、维生素（维生素A,C,E,K）、类胡萝卜素、多酚、辅酶（辅酶Q10, NAD（P）H）、小分子抗氧化物质（谷胱甘肽、硫辛酸）等。酶类的抗氧化剂包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、谷胱甘肽氧化还原酶等。抗氧化防御系统中的酶类抗氧化剂功能的正常发挥一般要依赖于非酶类抗氧化剂的支持。

细胞中的非酶类抗氧化防御系统

脂溶性的生育酚（维生素E）分子，主要在细胞膜中发挥抗氧化作用。在细胞膜中，维E分子六角形的头部靠近细胞膜表面，尾部嵌入细胞膜中。当维E分子的尾部被自由基氧化时，它便会移动到细胞膜表面，在那里维E分子的头部贡献出质子，维E分子被氧化。通过这种方式，维E分子将脂质过氧化物自由基从脂质膜中拉出来并中和，防止自由基对脂质膜造成破坏。因为细胞膜一旦遭到破坏，细胞膜的通透性改变，将直接影响细胞内环境的稳态。维E分子在中和自由基之后自身被氧化，它需要被抗坏血酸（维生素C）分子再生出具有抗氧化能力的维E分子。当维C分子不可用的时候，氧化的维E分子自身可能成为一个促氧化剂，即自由基的帮凶。

恢复了维E分子的抗氧化能力之后，维C分子自身被氧化成脱氢抗坏血酸。氧化的维C分子需要依赖还原型谷胱甘肽（GSH）使其恢复抗氧化性能。再生维C分子的代价是GSH被氧化为GSSG，GSSG还原为GSH则是以NADH为辅酶在GSH还原酶的作用下发生反应。以及在此图中没有显示出来的，辅酶Q10在发挥了抗氧化作用之后，自身也被氧化，也要通过NADH来再生其抗氧化能力。

NADH作为GSH还原酶的辅酶

细胞内的抗氧化防御系统其实是一环扣一环，而NADH就在抗氧化的级联反应中起到一个深层次抗氧化的作用。NADH虽然不是冲锋在抗氧化的一线，但却是抗氧化防御中最重要的后卫力量。

3. NADH的抗氧化能力：体外实验

3.1 NADH抗低密度脂蛋白氧化，保护血管

NADH对抗低密度脂蛋白（LDL）氧化的结果显示，当低密度脂蛋白在体外被过氧化氢（H2O2）自由基诱导时，NADH在最初的90分钟内显示出与抗坏血酸（维生素C）相同的抗氧化作用。但是，在90分钟后抗坏血酸不再起作用，而NADH仍具有抗氧化作用。即NADH能够更持久的对抗自由基对低密度脂蛋白的氧化。

低密度脂蛋白被氧化会对血管健康造成危害。 因为低密度脂蛋白一旦侵袭血管内皮细胞，并被氧化成氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）后会引发炎症，导致巨噬细胞进入血管内皮层，然后巨噬细胞会吞噬oxLDL，形成泡沫细胞化。当泡沫细胞崩坏时其会释放胆固醇，并成为动脉壁内动脉粥样化瘤，再造成血管平滑肌增殖、纤维性硬化与钙化，血管壁因而增厚，血管狭窄，最终会提高心血管疾病的风险。因此，从抗氧化方面而言，NADH对于血管壁有保护作用。

NADH能够更持久的对抗自由基对低密度脂蛋白的氧化

在存在抗坏血酸（红色）和NADH（蓝色）的情况下，AAPH *诱导的低密度脂蛋白（LDL）氧化过程中的二烯形成与对照（黄色）的关系。

低密度脂蛋白氧化造成血管内皮损伤、血管硬化、血管狭窄的图示

水杨酸也常被用来捕捉羟基自由基评估抗氧化剂的抗氧化能力，水杨酸被羟基自由基攻击后生成2,5-DHBA，铜离子（Cu2+）对自由基的反应起催化作用。从NADH与抗坏血酸的对比结果可以看出，存在水杨酸的缓冲溶液中加入NADH时，未观察到水杨酸的羟基化，并且9 h后仅损失了12％的NADH，而在同等条件下，抗坏血酸（维生素C）几乎损失殆尽。即使存在Cu2+催化剂时，NADH也比抗坏血酸有更强的抑制羟基自由基的作用。

NADH比抗坏血酸有更强的抑制羟基自由基的作用

在不存在（空心圆圈）或存在（实心圆点）Cu2+（10μM）的情况下，将水杨酸与500μM NADH（蓝色）或抗坏血酸（红色）一起孵育。左：抗氧化剂的消耗量；右：2,5-二羟基苯甲酸（2,5-DHBA）的生成。

3.2 NADH抑制脂质的过氧化反应

2004年发表在Biochemistry and molecular biology上的一篇研究论文做了NADH抗氧化的体外实验，证明NADH可以抑制蛋黄卵磷脂的过氧化。NADH可以与两种负责脂质过氧化的自由基（过氧基自由基和碳自由基）反应来保护脂质不发生氧化作用。NAD+不能直接与自由基反应抑制过氧化作用，因此NAD+当作对照实验。

NADH对甲氧基-AMVN诱发的蛋黄卵磷脂的过氧化的作用。氧气消耗量用µM O2/min表示。

不过不得不提的是NADH作为一种水溶性辅酶，它进入脂质膜的渗透性较差还是对于NADH保护膜脂质有一定限制，所以通过膳食补充剂抗氧化的朋友们将水溶性和脂溶性抗氧化成分一起补充，可以达到更好的抗氧化效果，比如维C加维E，NADH加辅酶Q10等搭配。

3.3 NADH清除神经细胞中的过氧化氢

早在2002年发表在Neurochemical Research上的一项研究也探讨过NADH对于神经细胞中的过氧化氢（H2O2）的清除能力。实验先是证明了H2O2对细胞的毒害作用，H2O2与神经细胞一起培养24小时，当H2O2浓度高达250μM时，细胞存活率已经下降到了60%；而当H2O2浓度高达500μM时，细胞几乎不能存活。

过氧化氢（H2O2）不同浓度对神经细胞存活率的影响

当细胞与 H2O2培养之前先用NADH或NAD+预处理1小时，可看到当NADH浓度达到3mM时显著保护了细胞的存活率，而相同浓度下NAD+对细胞存活率的保护作用非常有限。从随时间和浓度清除H2O2的动力学曲线上也能看出，NADH通过高效清除H2O2而起到了强抗氧化性的效果，而与此对应，NAD+并没有清除H2O2的作用。NADH通过其强大的抗氧化能力对H2O2的清除作用可以减少H2O2对中枢神经系统造成的炎性损伤，预防神经退行性疾病。

β-NADH和β-NAD+对细胞的保护作用。细胞培养在含500μM H2O2的培养基中

随时间和浓度β-NADH清除H2O2的动力学。

NAD+在浓度范围0.003-3mM内对于H2O2没有清除作用。

3.4 NADH抑制高铁血红蛋白的形成

血红蛋白是人体中负责运输氧气的一种蛋白，正常情况下血红蛋白（Hb）中的铁呈亚铁状态。而当血红蛋白自身被氧化为高铁血红蛋白（MetHb）时，它将失去运输氧的功能。自然状态下也会有一部分血红蛋白被氧化成高铁血红蛋白，以往的研究已经发现NADH作为红细胞中NADH-细胞色素b5（Cyt b5）还原酶的辅酶，参与高铁血红蛋白还原为亚铁血红蛋白，使自然状态下的高铁血红蛋白维持在低水平（0.5%以下）。而当各种氧化剂诱导形成的高铁血红蛋白过量时，会导致中毒性高铁血红蛋白血症。

在氧合血红蛋白（HbO2）被氧化成高铁血红蛋白的过程中会释放超氧阴离子（O2-·）：HbO2→ metHb +O2-·.超氧阴离子又通过歧化反应形成H2O2.除了活性氧（ROS），内在的活性氮（RNS）比如NO也可以与血红蛋白反应形成高铁血红蛋白。ROS和RNS大多由白细胞，巨噬细胞，上皮细胞等产生，并且红细胞总是暴露于其间。NO也由药物释放，比如硝酸甘油，西地那非等。其他可产生高铁血红蛋白的诱因包括NO吸入疗法、食物中防腐用的NaNO2等。

2017年日本奈良医学大学科学家发表在ACS chemical biology的研究论文又揭示了NADH抑制高铁血红蛋白形成的一些新机制。NADH单独或者与血红蛋白共存时有清除氧化剂（包括H2O2, NaNO2, NO）的功能。并且NADH与血红蛋白共存还显示出强烈的仿过氧化氢酶（pseudo-CAT）和仿超氧化物歧化酶（pseudo-SOD）的活性。NADH也能在有氧条件下清除NO。

A.NADH是红细胞中NADH-细胞色素b5还原酶的辅酶，参与高铁血红蛋白还原为亚铁血红蛋白。

B.(1). HbO2自氧化形成metHb和O2-·.NADH与HbO2共存证明了仿SOD和仿CAT活性，消除O2-·和H2O2, 抑制metHb形成。

(2). HbO2被H2O2氧化形成metHb. NADH与HbO2共存证明了仿SOD和仿CAT活性，消除H2O2,抑制metHb形成。

(3). HbO2被NO氧化形成metHb. NADH与NO在有氧条件下直接反应，抑制metHb形成。

(4). NO2-不直接与NADH反应。然而，随着HbO2和NO2-反应产生的H2O2和NO可以被NADH清除，抑制metHb进一步形成。

研究者还巧妙设计了一种人造红细胞模型（Hb-V）由血红蛋白囊泡包封纯化的氧合血红蛋白和NADH构成，此人造红细胞没有酶系统。体外实验已经证明，Hb-V中加入的NADH越多，越能抑制metHb的形成。而在氧化剂（H2O2, NaNO2, NOC7）存在的条件下，有包封NADH的Hb-V能使metHb的形成降低到三分之一，相对于没有包封NADH的Hb-V。

将Hb-Vs通过静脉注射到大鼠中，可以观察到包封NADH的Hb-V相对于不含NADH的Hb-V，可使高铁血红蛋白的形成降低一半。

体外实验：24小时培养之后MetHb的形成量与Hb-V中NADH含量的关系

体外实验：在H2O2(A), NaNO2(B), NOC7 (C)氧化剂存在条件下，包封NADH的Hb-V与不含NADH的Hb-V对于metHb形成随时间的影响。

4.NADH的抗氧化能力：人体实验

在一项安慰剂对照的双盲实验研究中，37名18 – 30岁的健康志愿者被分为两组。一组每天服用20毫克NADH，持续四周，另一组服用安慰剂。在六周的冲洗期后，两组交换，并再次给予NADH和安慰剂，为期四周。在服药的开始之前和结束时抽血进行实验。

对于吸烟者，NADH降低了丙二醛的浓度，尤其是氧化应激诱导的蛋白质羰基修饰。NADH使吸烟者升高的蛋白质羰基修饰水平稳定下降，并且在研究期内达到非吸烟者水平。这个小规模实验研究提供了一些证据，证明吸烟会导致丙二醛和蛋白质羰基修饰水平的升高，而NADH可以改善这些病理征象。

NADH对于吸烟者蛋白质羰基化水平的影响

参考文献：

1.Bishop N C, Blannin A K, Walsh N P, et al. Nutritional aspects of immunosuppression in athletes[J]. Sports Medicine, 1999, 28(3): 151-176.

2.Reibnegger G, Greilberger J, Juergens G, et al. The antioxidative capacity of ENADA-NADH in humans[J]. ICMAN Proceedings, 2002, 2

3.Olek R A, Ziolkowski W, Kaczor J J, et al. Antioxidant activity of NADH and its analogue-an in vitro study[J]. Journal of biochemistry and molecular biology, 2004, 37(4): 416-421.

4.Mazzio E A, Soliman K F A. Cytoprotection of pyruvic acid and reduced β-nicotinamide adenine dinucleotide against hydrogen peroxide toxicity in neuroblastoma cells[J]. Neurochemical research, 2003, 28(5): 733-741.

5.Yamada M, Sakai H. Hidden antioxidative functions of reduced nicotinamide adenine dinucleotide coexisting with hemoglobin[J]. ACS chemical biology, 2017, 12(7): 1820-1829.

Birkmayer G D. NADH, the Biological Hydrogen: The Secret of Our Life Energy[M]. Basic Health Publications, Inc., 2009.